Тест на стерильность, проведение теста

Методика

Методика проведения теста в соответствии с Ph.Eur.ст.2.6.1 или USP 71 и руководством по проведению теста из Ph.Eur. ст. 5.1.9. В настоящее время методики гармонизированы. Обе фармакопеи описывают две методики: прямое помещение пробы в питательную среду и фильтрации; к методу первого выбора относится фильтрация.

Условия теста

Тест на стерильность проводится при таких условиях, чтобы избежать контаминации из окружающей среды и чтобы не могло произойти подавление микроорганизмов в испытуемой пробе. Тест поводится в чистом помещении класса A (ISO 5) в окружающей среде класса B (ISO 7) и шлюзами класса C (ISO 8) или в изоляторе. Персонал должен быть обучен для проведения теста, пользуется одеждой, предписанной для соответствующих помещений. Помещения, в которых проводится тест, проходят регулярный мониторинг. Персонал также мониторят с помощью метода отпечатков.

Задействованный метод и условия инкубации

Fluid Thioglycollate medium (Тиогликолевая среда) – инкубация при 30 – 35°C в течение 14 дней

Soybean-Casein Digest Medium (триптон-соевый бульон) – инкубация при 20 – 25°C в течение 14 дней

Среды могут быть собственного производства, однако более экономично приобретать готовые питательные среды с декларированным составом и сертификатом соответствия поставщика; производитель гарантирует ростовые свойства и стерильность питательных сред, причем гарантия действует 1 год.

Испытание питательных сред на ростовые свойства

Все серии питательной среды, в том числе и от поставщиков, проходят в лаборатории контроль на ростовые свойства (Grow promotion test). В тиогликолевой среде должны размножаться анаэробные и аэробные микроорганизмы; триптон-соевый бульон – поддерживать рост аэробных бактерий и грибов. Принцип теста заключается в инокуляции отдельных образцов питательных сред небольшими дозами предписанных микроорганизмов (не больше 100 КОЕ). Инкубация инокулированных сред проходит при указанных выше температурах в течение 3 дней у бактерий и 5 дней у дрожжевых грибов и плесени (грибы).

Микроорганизмы для отдельных питательных сред:

Fluid Thioglycollate medium – Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes

Soybean-Casein Digest Medium – Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis

Количество проб

Минимальное количество проб в каждой подконтрольной серии предписано в таблицах в указанных выше фармакопейных статьях.

Мембранная фильтрация с помощью системы «СТЕРИТЕСТ»

Наиболее часто используемой альтернативой метода фильтрации в лабораториях является применение системы «Стеритест». Это прецизионный перистальтический насос, который обеспечивает фильтрацию пробы через соответствующую систему в зависимости от типа фильтруемой пробы. Фильтрация состоит из следующих шагов: непрерывное разбавление проб, фильтрация и смачивание фильтра культивационной средой с минимальным вмешательством оператора. Такой способ уменьшает возможность вторичной контаминации.

Приготовляются и описываются питательные среды, растворы, принадлежности и система фильтрации (2 канистры с фильтрами, гибкие трубки с иглами, зажимы и пробки) и все перемещается в материальный шлюз. Материал вместе с пробами проходит наружную дезинфекцию, после чего все помещается в асептический бокс на обработку.

«СТЕРИТЕСТ» соединяют со стерильным комплектом. В днище канистр встроен фильтр с порами 0,45 мкм

Перед использованием фильтры увлажняют небольшим количеством промывочного раствора

Содержимое пробы фильтруется напрямую или перед фильтрацией проводится ее непрерывное разбавление с помощью соответствующего раствора в зависимости от типа инъекций, после чего проводится фильтрация

Общий объем, профильтрованный через один фильтр, не должен превышать 1000 мл

Все фильтры после фильтрации промываются 3 раза по 100 мл 0,1% пептоновой воды (промывочный раствор); цикл промывки не должен превысить объем 5 раз по 100 мл по каждому отдельно взятому фильтру

Канистры укупориваются снизу, затем в каждую из них с помощью гибких трубок вводится по 100 мл культивационной среды (триптон-соевый бульон и тиогликолевая среда)

Гибкие трубки, ведущие к канистрам, отрезаются, канистры укупориваются и помещаются на инкубацию при заданных температурах

Продолжительность инкубации установлена сроком в 14 дней, текущий контроль проводится по истечении 7 дней, окончательный контроль – через 14 дней.

Отрицательный контроль – контроль остатков питательной среды, разбавляющего раствора и промывочного раствора. Растворы дозируют по каплям на поверхность триптон-соевого агара, инкубация в течение 14 дней при рекомендованных температурах. Прорастание микроорганизмов не должно быть обнаружено

Интерпретация результатов

Прекращение теста: В случае если при тесте на стерильность выявлено отклонение (дефект оборудования, контаминированная питательная среда, явная ошибка оператора), оператор обязан прекратить проведение теста. Обработанные пробы на инкубацию не поступают, тест следует повторить.

Первый тест: В процессе инкубации и в завершение инкубации рассматривается возможное прорастание микроорганизмов. Если рост не отмечается, испытуемые пробы проходят тест на стерильность с удовлетворительным результатом. В случае обнаружения роста, препарат не проходит тест на стерильность (неудовлетворительный результат), если на основании повторных тестов не было выявлено, что происхождение контаминации не связано с испытуемым препаратом.

Неудовлетворительный результат первого теста на стерильность считается спорным в случае если:

информация из микробиологического мониторинга, который проходил во время проведения теста на стерильность, показывает ошибку

проверка методики тестирования, задействованной во время проведения теста, выявляет ошибку

рост микроорганизмов будет обнаружена при отрицательном контроле

после идентификации микроорганизмов, изолированных в результате теста, обнаружение вида (видов) может быть четко отнесено за счет ошибок материала или методики, которые были задействованы при проведении теста на стерильность.

Любая идентификация при исследовании неудовлетворительных результатов должна проводиться на уровне генотипа с использованием метода РНК/ДНК (RNA/DNA). В случае если у лаборатории отсутствует возможность идентификации по генотипу, можно заказать такую услугу по контракту. Идентификация фенотипа (биохимические тесты) не всегда надежно подтверждает ложное соответствие двух изолятов, что может привести к ошибочному решению при выдаче разрешения на реализацию контролируемой серии.

Первый повторный тест. Число испытуемых проб и методика такие же, как при первом тесте.

Если рост микроорганизмов не выявлен, испытуемый препарат удовлетворяет требованиям теста на стерильность. В случае выявления роста микроорганизмов, препарат не соответствует требованиям теста на стерильность. Дальнейшее повторение теста на стерильность не допускается.

Проводится идентификация обнаруженных микроорганизмов, сравнивается изолят из первого теста с изолятом из первого повторного теста. Микроорганизмы также сравниваются с изолятами из микробиологического мониторинга производства несоответствующей серии.

Перед каждым тестом нового препарата, а также при изменении условий эксперимента проводятся валидационные тесты препарата.

Схема комплекта «Стеритест» для фильтрации

порошковые инъекции                                 ампулы

Яна Гаклова (Jana Haklová), доктор наук эксперт компании FAVEA

Favea.org